Jsou to látky obvykle (ale ne vždy) heterocyklické povahy, jejichž deriváty působí jako koenzymy různých enzymů. Právě u této skupiny se plně uplatňuje katalytická funkce vitaminů. Příkladem může mj. sloužit:

Vitaminy skupiny B se většinou nestanovují. Běžně se vyskytují v obilí, zelenině i jiných potravinách a jejich hypovitaminóza není příliš častá. Podrobněji zmíníme jen dva – vitamin B₁₂ a kyselinu listovou. Důvodem je, že se přece jen častěji vyskytne jejich deficit, a proto se jejich hladina v krevním séru v laboratořích stanovuje.

Tento vitamin, obsahující kobalt jako centrální atom uprostřed korinového jádra, je nezbytný pro tvorbu nukleových kyselin, a tedy pro dělení buněk. Jeho nedostatek se projeví megaloblastovou perniciózní anémií (či vlastně pancytopenií – nemocní mají i leukopenii a trombocytopenii). Přítomny jsou i neurologické příznaky.

Deficit není obvykle způsoben nedostatkem v potravě, ale poruchou absorpce při chronické atrofické gastritidě, kdy žaludeční sliznice netvoří mukoprotein potřebný pro vstřebávání vitaminu B₁₂, tzv. vnitřní faktor. U perniciózní anémie je příčinou tvorba autoprotilátek proti buňkám produkujícím vnitřní faktor i proti vnitřnímu faktoru samotnému.

Protože vitamin B₁₂ je prakticky jen v potravě živočišného původu, jeho nedostatkem mohou trpět vegani.

Transportní bílkovinou pro vitamin B₁₂ v plazmě je transkobalamin; pro deficit vitaminu B₁₂ svědčí snížená koncentrace této bílkoviny nasycené kobalaminem, tzv. holotranskobalaminu.

Je jako tetrahydroderivát koenzymem metabolismu jednouhlíkatých zbytků; uplatňuje se tak v řadě reakcí včetně tvorby nukleových kyselin. Je obsažena především v listové zelenině.

Nedostatek kyseliny listové se projevuje podobně jako deficit vitaminu B₁₂, tj. megaloblastovou anémií. Zvýšená potřeba kyseliny listové je u všech stavů, kde se množí buňky a tvoří DNA: v těhotenství (doporučuje se suplementace kyselinou listovou) a u zhoubných nádorů (antimetabolity kyseliny listové mají cytostatický účinek). Bakterie jsou schopné tvořit kyselinu listovou, esenciální je pro ně však její složka, kyselina p-aminobenzoová. Na tomto poznatku je založen antibakteriální účinek strukturně analogních sulfonamidů.

Vitamin C se uplatňuje při hydroxylačních reakcích; je nezbytný pro vznik hydroxyprolinu a hydroxylyzinu v kolagenu nebo pro syntézu noradrenalinu z dopaminu. Je to látka s významným antioxidačním účinkem; působí ve vodné fázi a spolupracuje s vitaminem E při ochraně buněčných membrán a lipoproteinů typu LDL před oxidací. Kyselina askorbová je obsažena v ovoci a zelenině.

Klasický obraz těžkého deficitu vitaminu C – skorbut (kurděje) – se prakticky nevyskytuje, mírný nedostatek je však poměrně častý, zejména u starších lidí.

Významná je interference kyseliny askorbové při některých analýzách. Tak její vysoká koncentrace v moči (vylučuje se močí při nadbytečném příjmu) může způsobit falešně negativní průkaz glukózy a zejména krve pomocí diagnostických proužků. Příčinou je reakce s peroxidem vodíku (vzniká při průkazu glukózy) či organickým peroxidem (užívá se při průkazu krve); ten pak nemůže vést k oxidaci chromogenu a vývoji zabarvení.

Ze stejných důvodů může vadit vyšší koncentrace kyseliny askorbové v krevním séru při stanovení kyseliny močové s urikázou a peroxidázou: i zde vzniká v prvé reakci peroxid vodíku, který je kyselinou askorbovou redukován a výsledkem je falešně nízká změřená koncentrace kyseliny močové. Tato interference by nastala i při enzymovém stanovení kreatininu, kde v předposlední reakci vzniká rovněž peroxid vodíku (viz kap. 10.2). Proto všichni výrobci do reakční směsi pro stanovení kyseliny močové a kreatininu přidávají askorbátoxidázu, která kyselinu askorbovou odstraní.

Pro zajímavost je třeba uvést, že všichni savci s výjimkou primátů a morčete jsou schopni kyselinu askorbovou vytvářet z glukózy ve čtyřstupňové reakci. Vyjmenovaným živočichům (včetně člověka) chybí poslední z potřebných enzymů (L-gulonolaktonoxidáza), a proto je pro ně kyselina askorbová vitaminem.