Tyto testy využívají reakce mezi antigenem a protilátkou. Reakce probíhají ve dvou fázích, kdy v první dochází k navázání specifické protilátky na konkrétní antigen a ve druhé fázi k vizualizaci této reakce. Podle typu antigenu, prostředí a detekce se rozdělují do několika skupin.

Povaha antigenu může být koloidní (rozpustný Ag) nebo korpuskulární („částicový“, nerozpustný Ag), tj. část nebo celá bakterie nebo např. latexová částice povlečená antigenem.

Stanovení může být buď kvalitativní, kdy je výsledek definován jako pozitivní nebo negativní, nebo kvantitativní, kdy se stanovuje titr (protilátek) nebo tzv. index pozitivity.

Aglutinace neboli shlukování je serologická metoda, při níž reaguje protilátka a korpuskulární antigen. V případě antigenu solubilního (rozpustného) musí být tento navázán na nějakou pevnou částici (např. latex), v tom případě hovoříme o aglutinaci na nosičích. Nejúčinněji působí protilátky IgM, protože mají nejvíce vazebných míst pro antigen, tudíž mohou vázat více buněk či částic a shlukování proběhne snadněji. Reakci můžeme provádět například na sklíčku či ve zkumavce, výsledkem je aglutinát (sraženina), který lze pozorovat pouhým okem, zbylá tekutina se vyčeří. Test lze provádět jak kvalitativně, tak kvantitativně, kdy se testuje sérum s různým titrem protilátek. Aglutinace se používá například ke stanovení protilátek proti bakteriím (rod Salmonella…) či krevních skupin.

Mezi aglutinační metody patří také hemaglutinace, kdy antigeny tvoří struktury povrchu erytrocytu a ty reagují s protilátkami vzniklými kvůli přítomnosti cizorodých organismů (např. průkaz infekční mononukleózy). Některé organismy obsahující hemaglutinin (např. viry chřipky) jsou schopné aglutinovat erytrocyty. K diagnostickým účelům se využívá tzv. hemaglutinačně inhibiční test. Pokud jsou v séru pacienta přítomny protilátky proti těmto virům, při reakci se naváží na virus, a tím jeho hemaglutinační schopnost inhibují. Erytrocyty tedy neaglutinují.

Precipitace (též imunodifuze) je metoda podobná aglutinaci, jen místo korpuskulárního antigenu reaguje s protilátkou antigen rozpustný (solubilní). V reakci musí být optimální poměr antigenu a protilátky, antigen musí mít tři a více antigenních determinant a protilátka minimálně dvě vazebná místa. Reakcí se vytvoří prostorová síť molekul, které se neudrží ve formě roztoku a vznikne tzv. precipitát = sraženina. Na agarových základech se vytvoří precipitační linie. Tuto metodu lze provádět buď v roztoku, nebo v gelu a lze hodnotit též kvalitativně i kvantitativně.

Elektroforéza spočívá v oddělení proteinů v elektrickém poli podle molekulové hmotnosti, provádí se na vhodném nosiči, jímž je většinou agarózový gel.

Patří sem elektroforéza sérových proteinů, tato metoda se používá jako screening. Sérové proteiny jsou rozděleny podle náboje, izoelektrického bodu a molekulové hmotnosti do 6 frakcí: albumin – α-1-globuliny – α-2-globuliny – β-1-globuliny – β-2-globuliny – γ-globuliny.V průběhu onemocnění se mění hladiny jednotlivých sérových bílkovin. Touto metodou lze zjistit, zda se jedná o zánět akutní či chronický, prokázat monoklonální protilátky či jaterní cirhózu.

Imunofixace se používá pro stanovení monoklonálního imunoglobulinu při elektroforetickém vyšetření séra. Po separaci sérových proteinů se přidají specifické protilátky proti těžkým a lehkým řetězcům. Vznikají charakteristické precipitační linie odlišné od obrazu fyziologického séra. Monoklonální imunoglobulin lze stanovit u některých krevních chorob, jako je např. myelom.

Podstatou rekce je vazba (vyvázání) komplementu komplexem antigenu s protilátkou. Pokud se komplement nenaváže, zůstává volný a po přidání erytrocytů do reakce způsobí jejich hemolýzu. Pokud je komplement navázán na komplex Ag-Ab, přidané erytrocyty zůstanou nezměněny. Využívá se pro stanovení protilátek u virových onemocnění.

Do reakce vstupuje v první fázi známý antigen, komplement (komplex bílkovin např. z morčecího séra) a vyšetřované sérum pacienta (v něm chceme detekovat přítomnost specifických protilátek). Během inkubace dojde ke vzniku komplexu Ag-Ab (pokud jsou ve vyšetřovaném séru Ab přítomny) a navázání komplementu na tento komplex. Ve druhé fázi se do reakce přidá hemolytický systém (tedy beraní erytrocyty senzibilizované králičí protilátkou). Pokud je komplement navázán na komplex Ag-Ab, erytrocyty se nezmění, sednou na dno jamky. Pokud v séru Ab přítomny nejsou, tedy komplement se nemá v první fázi na co navázat, naváže se následně na tento hemolytický systém a způsobí hemolýzu erytrocytů. Pozitivní výsledek = přítomnost protilátek v séru pacienta, je vyjádřen nezměněnými erytrocyty. Naopak negativní výsledek = v séru pacienta protilátky nejsou, je vyjádřen hemolýzou erytrocytů.

V tomto typu reakce brání přítomnost protilátky (a její navázání na antigen) biologickým účinkům antigenu. Reakce se prokazuje na vhodném systému.

Patří sem např. hemaglutinačně inhibiční test (viz výše) nebo také test ASLO anti streptolysin O. V tomto testu se detekují protilátky proti bakterii Streptococcus pyogenes, resp. proti jejímu toxinu tzv. streptolyzinu O. Indikace k vyšetření je dána podezřením na pozdní následky této infekce. Principem reakce je neutralizace (zablokování) hemolytického účinku tohoto toxinu na erytrocyty. Pozitivním výsledkem je zábrana hemolýzy erytrocytů navázáním protilátek proti tomuto toxinu přítomných v séru pacienta. Čím vyšší titr (množství) protilátek pacient má, tím je riziko pozdních následků vyšší (po běžném prodělání nemoci a úzdravě totiž titr protilátek klesá). Titr vyšší než 1:200 znamená vysokou pravděpodobnost autoimunní reakce, protilátky původně vzniklé proti bakterii začnou reagovat proti vlastním tkáním lidského organismu.

V těchto reakcích je jedna ze složek chemicky označena, a tím umožní vizualizace proběhlé vazby Ag-Ab. Podle charakteru značky se rozdělují do několika typů.

Pomocí této velice citlivé metody lze stanovit specifické protilátky nebo nízké koncentrace antigenů. Principem je reakce antigenu se specifickou protilátkou, na níž je navázán enzym (protilátka značená enzymem se nazývá konjugát). Ten pak reaguje se substrátem, chemickou reakcí vzniká produkt, který měříme. Různé typy imunoesejí používají různé produkty:

ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay detekuje barevný produkt pomocí spektrofotometru. Měří se OD optická denzita při určité vlnové délce. Výsledek se vztahuje k OD v jamkách s kontrolními séry po vytvořeni kalibrační křivky. Vymezení hranice negativity a pozitivity se nazývá cut-off.

FEIA Fluorescent Enzyme Immuno Aassay detekuje fluorescenční produkt za použití fluorimetru.

LEIA Luminiscence-enhanced Enzyme Immuno Assay detekuje luminiscenční produkt luminometrem.

Tyto metody jsou spojené s pevnou fází – reakční složka je navázána (tzv. nakoutována, z anglického coat – potáhnout) na pevný povrch jamky v mikrotitrační destičce. Podle typu vrstvení jednotlivých komponent se dělí na sendvičové, kompetitivní, metodu záchytných protilátek tzv. capture.

Metoda se jmenuje Western blot na základě slovní hříčky. Podobná metoda Southern blot, dříve vyvinutá Edwinem Southernem, se používá k detekci DNA.

Hrubý antigenní preparát (protein) je rozdělen na jednotlivé složky podle molekulární hmotnosti, nejčastěji elektroforézou v gelu. Tím vzniknou proužky s jednotlivými antigenními složkami, které jsou přeneseny na membránu. Tak je vytvořena pevná fáze, na které proběhne ELISA. Výsledkem je po enzymatické reakci produkt, který se projeví barevnou změnou příslušného specifického proužku – antigenu.

Tyto techniky slouží k přesnému stanovení specifických protilátek proti konkrétním antigenům v diagnostice infekčních chorob. Jsou pracnější než běžná ELISA, ale mnohem přesnější, specifičtější. Dále se využívají k analýze antigenních (proteinových) směsí v různých oborech (imunologii, chemii…).

Postup jednotlivých kroků metody nepřímá ELISA si prohlédněte na video na tomto odkazu:

RIA Radio Immuno Assay se používá zejména pro stanovení antigenů typu hormonů, léků, vitamínů atd. Je velmi citlivá a specifická. K vizualizaci se používá radioaktivní prvek (radioizotop), nejčastěji jód. Výsledek lze kvantifikovat.

Používá se k detekci antigenů. Na sklíčko je nanesen vzorek, ve kterém hledáme antigen. Je navrstven roztok se specifickou protilátkou značenou fluorescenčním barvivem. Pokud dojde k vazbě Ag-Ab po promytí zůstane fluorescenčně značená protilátka fixovaná a komplex se detekuje ve fluorescenčním mikroskopu. Pokud není antigen k protilátce komplementární, značená protilátka se nenaváže, vymyje se a fluorescence není přítomna (reakce je negativní).

Tato metoda se používá pro vyšetření séra k průkazu autoprotilátek. Sérum pacienta se inkubuje na podložním sklíčku s fixovaným reparátem. Vznikají imunokomplexy (Ag-Ab), které jsou detekovány pomocí fluorescenčně značených specifických protilátek proti jednotlivým izotypům imunoglobulinů. Metoda je hodnocena fluorescenční mikroskopií, nejčastěji se používá ke stanovení autoprotilátek ANA, anti-dsDNA, ANCA aj.