5.4
Měření velikosti mikroorganismů
Velikost mikroorganismů, tj. délka a šířka buněk, fruktifikačních orgánů, spor a zvláštních struktur, náleží k diagnostickým znakům mikroorganismů. Nesmíme však zapomenout, že to není veličina stálá, ale značně proměnlivá. Velikost mikroorganismů je ovlivněna četnými činiteli, spojenými s fyziologickým stavem buněk i vnějšími podmínkami. I za daných vnějších podmínek kolísá velikost buněk téže kultury v různě širokém rozmezí, jež zjišťujeme stanovením minimálních a maximálních hodnot. Jako výsledek potom udáváme toto variační rozpětí: např. délka 3 – 7 μm, šířka 0,5 – 1,5 μm apod.
Pro získání přesnějšího obrazu skutečného stavu musíme získat velký počet hodnot a ty pak zpracovat statisticky. Na proměřování délky a šířky mikrobů v optickém mikroskopu používáme speciální okulár, do něhož je vloženo jemné měřítko. Rozměry se udávají v μm.
Souhrn
Okuláry používané k měření:
- Okulárový mikrometr
- Měřící okulár
5.4.1
Práce s okulárovým mikrometrem
Okulárový mikrometr je okulár, který má na skleněné destičce vyrytou stupnici rozdělenou na 100 dílků, desítky jsou očíslovány. Okulárový mikrometr se vymění za běžný okulár zasunutím do tubusu. Výměna musí proběhnou rychle, aby nedošlo k naprášení do tubusu.
+
Obr. 65. Okulárový mikrometr
+
Obr. 66. Okulárový mikrometr zorné pole
Poznámka
Kalibrace – měření mikrometrické hodnoty.
Před vlastním měřením velikosti si musíme zjistit, jaké délce se ve skutečnosti rovná v našem mikroskopu 1 dílek okuláru. Skutečná délka dílku totiž závisí na délce tubusu a zvětšení objektivu. K proměření MH (mikrometrická hodnota) slouží objektivový mikrometr, na kterém je délka dílku 10 μm (0,01 mm).
+
Obr. 67. Objektivový mikrometr
+
Obr. 68. Objektivový mikrometr zorné pole
+
Obr. 69. Překrytí stupnic
Příklad
Úkol: Proveďte kalibraci – měření mikrometrické hodnoty.
Pomůcky: mikroskop, objektivový mikrometr, okulárový mikrometr
Postup:
- Do tubusu mikroskopu vsadíme okulárový mikrometr. Je to okulár, mezi jehož čočkami je destička se stupnicí.
- Na stolek mikroskopu položíme sklíčko, na němž je vyryta stupnice se 100 dílky po 0,01 mm, tzv. objektivový mikrometr.
- Na mikroskopu nastavíme objektiv, kterým budeme měřit velikost mikroorganismů (např. 10x) a zaostříme objektivový mikrometr, vidíme tedy v okuláru dvě stupnice, okulárovou s čísly a objektivovou bez čísel.
- Stupnici na okulárovém mikrometru nastavíme rovnoběžně s objektivovým měřítkem, dobře zaostříme.
- Přesně do zákrytu nastavíme levou stranu prvních dílků okuláru i objektivu, pak nepohybujeme se stupnicemi a vyhledáme další dvojici dílků, které se přesně kryjí.
- Zapíšeme si počet dílků okuláru a počet dílků objektivu, které se přesně kryjí.
- Vyhledáme ještě dvě takové dvojice a hodnoty si zapíšeme do tabulky, která platí pro danou optickou soustavu (tedy zvětšení objektivu).
- Z každé dvojice vypočítáme MH, a pokud se nepatrně liší, stanovíme průměr, který je výslednou MH.
- Takovým způsobem si stanovíme mikrometrické hodnoty okulárové stupnice pro všechny objektivy našeho mikroskopu.
Vyhodnocení:
Sestavíme tabulku, kam zapíšeme počet dílků okuláru a počet dílků objektivu, které se přesně kryjí, a vypočítáme mikrometrickou hodnotu pro použitá zvětšení.
[μm]
Závěr:
Uvedeme zjištěnou mikrometrickou hodnotu a výsledky porovnáme v rámci celé skupiny.
Příklad
Úkol: Změřte velikost sporangií plísně rodu Mucor.
Pomůcky:
- materiál: plíseň rodu Mucor na agarové živné půdě v Petriho misce
- ostatní pomůcky: okulárový mikrometr, objektivový mikrometr, mikroskop
Postup:
Stanovení MH při zvětšení objektivu 10x – viz předcházející měření MH
Měření velikosti sporangií
- Na stolek mikroskopu položíme otevřenou Petriho misku s plísní a zaostříme sporangia, jsou v horní části mycelia, mají kulovitý tvar, tmavý odstín.
- Stupnici na okuláru nastavíme přesně do průměru kulovitého útvaru sporangia a zapíšeme počet dílků stupnice přes průměr sporangia s přesností na 1/4 dílku.
- Vyhledáme další sporangium, zaostříme, změříme atd. Pro statistické zpracování velikosti průměru je třeba 100 – 200 měření.
Vyhodnocení:
Sestavíme tabulku hodnot (číslo měření, počet dílků okuláru, průměrný počet dílků) a provedeme výpočty.
- Průměrná velikost: průměrný počet dílků x MH [μm]
- Maximální velikost: maximální počet dílků x MH [μm]
- Minimální velikost: minimální počet dílků x MH [μm]
Závěr:
Uvedeme zjištěnou průměrnou velikost sporangií a porovnáme přesnost měření v rámci celé skupiny.
5.4.2
Práce s měřícím okulárem
Měřící okulár se skládá z vlastního okuláru a otočného bubínku, na tubus mikroskopu se připevňuje šroubem. Při pohledu do okuláru vidíme stupnici rozdělenou na 10 dílů a vlasový kříž s dvojitou čárou ve stupnici, kterým se pohybuje podélně pod stupnicí otočným bubínkem. Poloha vlasového kříže se zapisuje trojmístným číslem: stovky na stupnici vpravo od dvojité čáry, desítky a jednotky na otočném bubínku. Velikost měřícího objektu se získá z rozdílu dvou krajních poloh vlasového kříže. Posuv kříže musí kopírovat měřenou délku. Tento způsob měření je přesnější než s použitím okulárového mikrometru.
Před vlastním měřením si musíme opět zjistit délku dílku okulárové stupnice. Použijeme objektivový mikrometr.
+
Obr. 70. Měřící okulár
+
Obr. 71. Měřící okulár uložení
+
Obr. 72. Měřící okulár zorné pole
Příklad
Úkol: Proveďte kalibraci – měření mikrometrické hodnoty.
Pomůcky: mikroskop, objektivový mikrometr, měřící okulár
Postup:
- Na stolek mikroskopu upevníme objektivový mikrometr.
- Na mikroskopu nastavíme objektiv, kterým budeme měřit velikost mikroorganismů (např. 40x) a zaostříme objektivovou stupnici. Vidíme dvě stupnice, jednu okulárovou s číslicemi a druhou objektivovou.
- Objektivovou stupnici umístíme rovnoběžně se stupnicí okuláru a vlasový kříž svým středem umístíme přesně na čárku objektivové stupnice vpravo, zapíšeme polohu kříže (b1) – stovky vpravo od dvojité čáry, desítky a jednotky na bubínku.
- Preparátem již nepohybujeme, pouze přesuneme vlasový kříž vlevo o přesný počet dílků objektivu (např. 5 dílků = a) a polohu kříže opět zapíšeme (b2).
- Měření provedeme alespoň 3x, sestavíme tabulku a vypočítáme mikrometrickou hodnotu při daném zvětšení objektivu, pokud se MH neshodují, vypočítáme průměrnou hodnotu.
Vyhodnocení:
Sestavíme tabulku hodnot pro jednotlivá zvětšení a provedeme výpočet MH.
b1 | b2 | a | ||
Závěr:
Uvedeme zjištěnou mikrometrickou hodnotu a výsledky porovnáme v rámci celé skupiny.
Příklad
Úkol: Změřte délku makrokonidií plísně rodu Alternaria.
Pomůcky:
- materiál: plíseň rodu Alternaria na agarové živné půdě v Petriho misce
- barviva, roztoky: laktofenol
- ostatní pomůcky: podložní a krycí sklíčka, preparační jehly, měřící okulár, objektivový mikrometr, mikroskop
Postup:
Příprava laktofenolového preparátu
- Na čisté podložní sklíčko kápneme větší kapku laktofenolu.
- Pomocí preparačních jehel odebereme část porostu tmavého mycelia plísně a přeneseme do kapky laktofenolu.
- Přikryjeme opatrně krycím sklíčkem, tak aby byl preparát bez vzduchových bublin.
Stanovení MH měřícího okuláru
- Vysuneme okulár z tubusu mikroskopu a nahradíme měřícím okulárem, který upevníme šroubem na tubus.
- Protože velikost makrokonidií budeme měřit při zvětšení objektivu 40x musíme znát správnou MH této měřící soustavy.
- Měření provedeme podle postupu při kalibraci pomocí objektivového mikrometru.
Měření délky makrokonidií
- Na stolek mikroskopu položíme připravený laktofenolový preparát, zaostříme.
- Vyhledáme makrokonidii a umístíme ji tak, aby vlasový kříž byl svým středem na pravém okraji délky, podle potřeby otáčíme tubusem okuláru, vlasový kříž nastavujeme bubínkem, směr kříže musí kopírovat délku makrokonidie, preparátem nepohybujeme, zapíšeme hodnotu b1.
- Pomocí bubínku umístíme vlasový kříž na levé straně délky konidie a zapíšeme jeho polohu b2, nesmíme pohybovat preparátem.
- Vyhledáme pohybem preparátu další makrokonidii, přesně nastavíme polohu kříže i makrokonidie, zapíšeme b1, posuvem vlasového kříže b2 atd.
- Snažíme se získat alespoň 10 údajů.
Vyhodnocení:
Sestavíme tabulku měření a provedeme výpočty.
Číslo měření | b1 | b2 | |
Ø b |
- Průměrná délka makrokonidií: Øb x MH [μm]
- Maximální velikost: maximální počet dílků x MH [μm]
- Minimální velikost: minimální počet dílků x MH [μm]
Závěr:
Uvedeme zjištěnou velikost makrokonidií a výsledky porovnáme v rámci celé skupiny.