Norma popisuje horizontální metodu stanovení počtu životaschopných bakterií Clostridium perfringens. Platí pro výrobky určené pro lidskou výživu a ke krmení zvířat a vzorky z prostředí potravinářských výroben a prodejen.

Do Petriho misek se očkuje určený objem zkušebního vzorku, výchozí suspenze, nebo desetinásobných ředění. Inokulum se zalévá selektivní kultivační půdou SC agar (tryptozový agar s metabisulfitem a cykloserinem bez vaječného žloutku) a poté se stejnou kultivační půdou převrství. Naočkované plotny se inkubují, anaerobně při 37 °C po dobu (20 ±2) h. Pak se zjistí počet charakteristických kolonií. Určený počet charakteristických kolonií se podrobí konfirmaci a výpočtem se stanoví počet C. perfringens v mililitru nebo gramu vzorku.

Očkujeme přelivem vždy souběžně do dvou prázdných Petriho misek. Do středu misek se sterilní pipetou přenese 1 ml inokula a přeleje se asi 10 – 15 ml SC agaru vytemperovaného na 44 – 47 °C. Po nalití se půda dobře promíchá opatrnými krouživými pohyby miskou. Po utuhnutí půdy se převrstvi ještě 10 ml téhož SC agaru. Tato svrchní vrstva se nechá utuhnout. Plotny obrácené dnem vzhůru se umístí do anaerostatů nebo jiné vhodné nádoby a inkubují se za anaerobních podmínek při 37 °C po dobu (20 ±2) h. Delší inkubace, může vést k nadměrnému zčernání půdy.

Po ukončení specifikované doby inkubace se vyberou plotny, na nichž vyrostlo méně než 150 kolonií. Pokud je to možné, vyberou se z nich plotny, které byly očkované dvěma po sobě následujícími ředěními. Na každé z ploten se spočítají charakteristické kolonie presumptivního C. perfringens. Z každé plotny se vybere po pěti charakteristických koloniích ke konfirmaci.

Pro biochemickou konfirmaci lze zvolit jednu ze dvou konfirmačních technik nebo použít komerčně dostupné sady biochemických testů.

Každá z vybraných kolonií se naočkuje do tekuté thioglykolátové půdy a inkubuje se za anaerobních podmínek při 37 °C po dobu 18 – 24 hodin. Po ukončení inkubace se sterilní pipetou neprodleně přenese pět kapek kultury z thioglykolátové půdy do půdy LS (půda k testování fermentace laktózy a redukce siřičitanu). Inkubuje se za aerobních podmínek při 46 °C po dobu 18 – 24 h.

U zkumavek s půdou LS se hodnotí tvorba plynu a přítomnost černého zbarvení (precipitátem sirníku železnatého). Za pozitivní se povazují ty zkumavky, v nichž jsou Durhamovy plynovky naplněny plynem z více než jedné čtvrtiny a v nichž se současně zjistí černý precipitát.

V případě pochybností, je-li ve zčernalé půdě Durhamova plynovka naplněna plynem z méně než jedné čtvrtiny, se sterilní pipetou neprodleně přenese pět kapek kultury z půdy LS do další zkumavky s půdou LS. Inkubuje se při 46 °C po dobu 18 – 24 h. Tyto zkumavky se hodnotí, jak je popsáno výše. Ve všech ostatních případech je třeba zkumavky považovat za negativní.

Bakterie, které vytvářejí na půdě SC charakteristické kolonie a které poskytují pozitivní konfirmační reakce v půdě LS, se považují za C. perfringens.

Pro tuto konfirmační techniku je nezbytné použít dobře izolované charakteristické kolonie. V opačném případě (když je povrch ploten pokryt souvislým nárůstem a není možné vybrat charakteristické kolonie jako dobře izolované) se vybere 5 takových charakteristických kolonií a každá z nich se subkultivuje do tekuté thioglykolátové půdy, z níž byl předem vypuzen vzduch.

Inkubuje se za anaerobních podmínek při 37 °C po dobu 18 – 24 hodin. Z každé takto získané subkultury se vyočkuje kličkou na povrch plotny se základem SC agaru a dobře se rozočkuje, inokulum se převrství 10 ml základu SC agaru.

Nechá se utuhnout a inkubuje se za anaerobních podmínek při 37 °C po dobu 18 – 24 hodin. Z každé plotny se vybere nejméně jedna charakteristická a dobře izolovaná kolonie. V případě potřeby se vyočkování kličkou na plotnu se základem SC agaru a rozočkovaní po jeho povrchu opakuje, dokud se nezískají dobře izolované charakteristické černé kolonie. Každé takové kolonie se dále konfirmují.

Každá z vybraných kolonií se inokuluje vpichem do půdy k testování pohyblivosti a redukce dusičnanů, z níž byl bezprostředně před použitím vypuzen vzduch. Kultivuje se za anaerobních podmínek při 37 °C po dobu 24 hodin. Hodnotí se charakter růstu podél vpichu. Pohyblivost testované kultury se projevuje difuzním růstem ve sloupci půdy ve všech směrech od linie vpichu.

Přítomnost dusitanů se detekuje pomocí činidla k jejich průkazu (roztok kyseliny 5-amino-2-naftalensulfonové a kyseliny sulfanilové). Do každé zkumavky s půdou k testování pohyblivosti a redukce dusičnanů se dělenou pipetou opatřenou pryžovým balónkem přidá 0,2 ml až 0,5 ml tohoto činidla.

Červené zbarvení svědčí pro redukci dusičnanů na dusitany. Pokud se červené zbarvení nevytvoří do 15 minut, přidá se malé množství zinkového prachu a vyčká se 10 minut. Pokud se červené zbarvení vytvoří až po přidání zinku, svědčí to o tom, že testovaná kultura dusičnany neredukuje.

Každá z vybraných kolonií se inokuluje do půdy k testování fermentace laktózy a zkapalňování želatiny, z níž byl bezprostředně před použitím vypuzen vzduch. Inkubuje se za anaerobních podmínek při 37 °C po dobu 24 hodin.

Ve zkumavkách s půdou k testování fermentace laktózy a zkapalňování želatiny se zjišťuje přítomnost plynu a zežloutnutí půdy (v důsledku tvorby kyseliny), což společně svědčí pro fermentaci laktózy. Schopnost testované kultury zkapalňovat želatinu lze hodnotit po ochlazení zkumavek při 5 °C po dobu 1 hodiny. Pokud k očekávanému zkapalnění půdy nedošlo, opakuje se inkubace po dobu dalších 24 hodin a znovu se zjišťuje, zda kultura želatinu zkapalňuje.

Bakterie, které vytvářejí na SC agaru černé kolonie, jsou nepohyblivé, redukují dusičnany na dusitany, fermentují laktózu za tvorby kyseliny a plynu a zkapalňují želatinu do 48 hodin, se pokládají za C. perfringens. Kultury, které redukují dusičnany na dusitany slabě (tj. vytváří se jen růžové zbarvení), je třeba vyloučit, neboť pro C. perfringens je charakteristická intenzivní a bezprostřední pozitivní reakce.