Tato norma popisuje horizontální metodu stanovení počtu životaschopných presumptivních bakterií druhu Bacillus cereus, a to technikou počítaní kolonií vykultivovaných při 30 °C. Platí pro výrobky určené pro lidskou výživu a ke krmení zvířat a vzorky z prostředí potravinářských výroben a prodejen.

Stanovení tohoto zdravotně významného podmíněně patogenního druhu je založeno na důkazu lecitinázy na masopeptonovém agaru s vaječným žloutkem. Selektivita a diagnostická hodnota se zvyšuje přídavkem mannitolu, fenolové červeně a polymyxinu B.

Na povrch tuhé selektivní kultivační půdy v Petriho miskách se očkuje určený objem zkušebního vzorku, nebo určený objem výchozí suspenze. Jako zkušební půda je stanovena půda MYP (Mannitol Yolk Polymyxine B agar). Stejně se postupuje při očkování desetinásobných ředění zkušebního vzorku nebo výchozí suspenze na další plotny. Inokulované Petriho misky se kultivují v termostatu aerobně při 30 °C po dobu 18 – 48 hodin. Následuje konfirmace vybraných typických kolonií na KA a podle výsledků konfirmace, kdy hodnotíme hemolytickou aktivitu, se provede úprava počtu kolonií na miskách. Počet B. cereus v 1 gramu nebo v 1 mililitru vzorku se vypočítá z počtu konfirmovaných kolonií vyrostlých na plotnách.

Zkoušený vzorek asepticky otevřeme a připravíme příslušný počet ředění, který vychází z předpokládaného počtu mikroorganismů. Očkujeme roztěrem na MYP agar, který je nalitý na plotnách, a to vždy novou sterilní pipetou po 0,1 (0,2) ml souběžně na dvě Petriho misky.

Pokud je u některých výrobků žádoucí stanovit nízký počet B. cereus, pak můžeme zvýšit záchytnost tím, že očkujeme 1 ml inokula na povrch jedné velké Petriho misky o průměru 140 mm nebo rozděleně po 0,33 ml na povrch tří Petriho misek o průměru 90 mm. V obou případech očkujeme paralelně na dvě velké misky nebo šest malých misek.

Inokulum se co nejrychleji pečlivě rozetře po povrchu misky pomocí roztírací tyčinky tak, aby nedošlo k dotyku tyčinky se stěnou misky. V Petriho miskách uzavřených víčkem se inokulum nechá vsáknout do agarové půdy při laboratorní teplotě po dobu asi 15 minut. Naočkované misky obrácené dnem vzhůru se inkubuji 18 – 24 hodin při 30 °C, případně dalších 24 hodin.

Odečítání výsledků provádíme po 24 hodinách, nejsou-li kolonie zřetelně viditelné, inkubujeme misky dalších 24 hodin. Po ukončení inkubace se vyberou misky, přednostně očkované dvěma po sobě následujícími ředěními, na nichž vyrostlo méně než 150 kolonií. Kolonie presumptivního B. cereus se spočítají na každé z ploten zvlášť.

Pokud na miskách naočkovaných neředěným tekutým výrobkem, nebo naočkovaných nejnižším ředěním u ostatních výrobků, vyrostlo méně než 15 typických kolonií, lze provést odhad počtu. V případě, že jsme použili k očkování inokulum 1 ml rozděleně na 3 misky, pak pro následující počítání a konfirmaci uvažujeme, tak jako by to byla jedna miska.

Typické kolonie B. cereus po 24 hodinách kultivace:

Atypické kolonie B. cereus po 24 hodinách kultivace:

Typické kolonie B. cereus po 24 hodinách kultivace:

Z každé plotny vybrané k výpočtu se vybere po pěti typických koloniích. Pokud na plotně vyrostlo méně typických kolonií než pět, vyberou se všechny. Pokud se na plotnách vytvořil souvislý nárůst a není možné vybrat kolonie jako dobře izolované, vybere se odtud pět typických kolonií a každá z nich se subkultivuje na plotnu kompletní půdy (MYP agar). Inkubujeme při 30 °C po dobu 18 – 24 hodin. Z každé plotny se vybere nejméně jedna dobře izolovaná růžově zbarvená kolonie. Tato kolonie se konfirmuje.

Část vybrané kolonie se naočkuje na povrch agaru s ovčí krví čarou, vpichem nebo ve formě kapky způsobem, který umožňuje dobrou interpretaci hemolytické reakce. Inkubuje se při 30 °C po dobu 24 hodin a poté se hodnotí hemolytická reakce.

Pokud je alespoň 80 % kolonií, které byly z dané misky vybrány ke konfirmaci potvrzeno jako presumptivní B. cereus, počet kolonií na misce se nijak neupravuje. Ve zbylých případech se počet kolonií na misce musí upravit podle procentuálního podílu zastoupených konfirmovaných kolonií z celkového počtu kolonií, které byly vybrány ke konfirmaci (1 kolonie – 20 %, 2 kolonie – 40 %, 3 kolonie – 60 %, 4 kolonie – 80 %, 5 kolonií – 100 %).

Jestliže na dvou miskách naočkovaných neředěným zkušebním vzorkem nebo výchozí suspenzí nebyly zjištěny žádné kolonie presumptivního B. cereus, vyjádří se výsledek takto: