Stanovení je založeno na selekci spor inaktivačním záhřevem nebo chemickými činidly (neomycin, polymyxin, azid sodný) a následnou kultivací za nepřístupu vzduchu nebo na půdách obsahujících redukující látky.

Zjišťovat se mohou všechny anaerobní sporulující bakterie bez bližší diferenciace, nebo se rozlišují fakultativně anaerobní bacily od klostridií, případně některé skupiny a druhy rodu Clostridium (C. perfringens). Používá se k tomu selektivně diagnostických půd umožňujících určit rozdílnou schopnost redukovat sulfity na sulfidy, specificky měnit vzhled půdy s vaječným žloutkem a růst v přítomnosti některých antibiotik.

Následující tři uvedené zkoušky jsou nejjednodušší a neumožňují rozlišit druhy rodu Clostridium od fakultativně anaerobních druhů rodu Bacillus. Uskutečňují se kultivací ve vysokém sloupci půdy převrstvené sterilní parafin-vazelínovou směsí nebo parafinovým olejem. Množství spor přítomných ve vzorku se zjistí podle počtu pozitivních zkumavek očkovaných řadou za sebou následujících desítkových ředění technikou MPN.

Používá se hlavně ke kontrole mléka. Do sterilního mléka ve zkumavce se napipetuje vzorek. Převrství se 5 – 10 mm vysokou vrstvou sterilní parafin-vazelínovou směsí. Inaktivuje se ve vodní lázni při 85 °C 10 minut. Pak se vychladí na 37 °C a při této teplotě inkubuje 5 dní. Jsou-li sporuláty přítomny, způsobí koagulaci, peptonizaci nebo tvorbu plynu, případně kombinaci uvedených projevů. Počet spor se stanoví technikou MPN.

Sterilní bujón ve zkumavkách se naočkuje, převrství parafinem, inaktivuje při 80 °C 15 minut. Přítomnost sporulujících anaerobů se projeví zákalem, vznikem sedimentu, tvorbou plynu, po kultivaci 5 – 7 dní při 37 °C. Počet se stanoví technikou MPN.

Rozpuštěná půda ve zkumavkách, vytemperovaná na 45 °C, se naočkuje a přelije parafinem. Inaktivuje a kultivuje se jako v předcházející metodě. Odečítají se kolonie vyrostlé ve sloupci půdy. Dojde-li k částečnému ztekucení a zákalu půdy, případně rozrušení sloupce půdy vytvořeným plynem, nelze jednotlivé kolonie rozeznat a samostatně odečítat. V takovém případě se výsledky hodnotí jako při použití tekuté půdy technikou MPN.

Naočkované Petriho misky se ukládají do anaerostatů nebo anaerobních komor, nouzově do exikátorů. V těchto zařízeních lze chemickou reakcí vázat volný kyslík obsažený v atmosféře kultivačního prostoru a nahradit jej jinými plyny. Nebo se vzduch odsaje vývěvou a nahradí směsí dusíku, oxidu uhličitého a vodíku. Za těchto podmínek rostou i přísně anaerobní druhy na povrchu půd v Petriho miskách.

Anaerostaty jsou nádoby určené pro kultivaci anaerobních a mikroaerofilních mikroorganismů. Můžou být z nerezové oceli, tlustostěnného skla nebo z čirého polykarbonátu, nejčastěji s plastovým víkem a přírubou, se zabudovanými ventily a manometrem pro kontrolu tlaku v nádobě. Příslušenství tvoří také vkládací nerezové stojánky pro Petriho misky. Velikost nádoby se nejčastěji pohybuje od 2 do 6 litrů.

Do anaerostatů se vkládá generátor plynů, který je určen k tvorbě anaerobního prostředí. Obsahuje např. směs hořčíku, kyseliny vinné a uhličitanu sodného. Po zvlhčení určitým objemem vody se začnou uvolňovat plyny – vodík a oxid uhličitý. Přibližné složení atmosféry po aktivaci: 71 % dusíku, 10 % oxidu uhličitého, 19 % vodíku. Generátor je určen pro jedno použití.

Dále se vkládá katalyzátor, kterým je kovové paládium na aluminiovém nosiči. Paládium katalyzuje slučování kyslíku přítomného v nádobě s vyvíjeným vodíkem za vzniku vody. Katalyzátor lze použít opakovaně (až 30x), po každém použití se však musí vysušit v sušárně a uchovávat v exikátoru.

Jestliže živná půda obsahuje sloučeniny snižující dostatečně redox potenciál, mohou anaerobní bakterie růst a tvořit kolonie, i když kultivace probíhá v normální vzdušné atmosféře. Takovými látkami jsou thioglykolát sodný, formaldehyd sulfoxylát sodný, cystin, cystein, kyselina askorbová, redukované železo, extrakty ze srdcí a jater apod. Uvedené principy lze využít jak pro kultivaci v tekutých půdách ve zkumavkách, tak pro kultivaci v agarových půdách v Petriho miskách.

Výsledky stanovení jsou velmi závislé na použité metodě. Obecně platí, že různé kmeny klostridií nejsou stejně citlivé na záhřev. Pozitivní reakci mohou někdy vyvolat i termorezistentní nesporulující anaerobní bakterie.

Přesnější jsou metody plotnové, které navíc umožňují makroskopickou a mikroskopickou kontrolu kolonií.