Metody stanovení – plotnová metoda. Metoda je vhodná pro vzorky, které obsahují více než 300 mikroorganizmů v 1 g nebo 30 mikroorganizmů v 1 ml. Je to metoda klasická.

Používaná živná půda GTK (PCA – Plate Count Agar)

Význam složek: G – glukóza – zdroj uhlíku a energie, T – trypton (pepton) – získává se enzymatickou hydrolýzou kaseinu, zdroj aminokyselin a polypeptidů, K – kvasničný extrakt – z autolyzovaných kvasnic, zdroj uhlíku, vitamínů, růstových faktorů, agar – zahušťovadlo, destilovaná voda.

Jednotlivé složky se odváží podle receptury a rozpustí v destilované vodě. Provede se úprava pH na 7,0 a živná půda se steriluje v autoklávu po dobu 15 minut při 121 °C.

Očkování se provádí se přelivem – 1 ml daného ředění na jednu Petriho misku, vždy tři po sobě jdoucí ředění, po dvou Petriho miskách. Kultivuje se i jedna Petriho miska s nalitou živnou půdou bez očkování – slouží jako kontrola živné půdy.

Misky se kultivují dnem vzhůru aerobně při teplotě 30 °C, 72 hodin. Stanoví se počet kolonií tvořících jednotky (KTJ). K výpočtu se použijí plotny, kde narostlo 10 až 300 kolonií.

Modifikace živné půdy: MPA, MPAL, MPAG.

Živná půda: VČŽG (VRBG), selektivně diagnostická, steriluje se frakcionovaně.

Význam složek: V – krystalová violeť, inhibitor G⁺ bakterií (hlavně enterokoků a stafylokoků), Č – neutrální červeň, indikátor pH (neutrální prostředí: oranžová, kyselé: červená, alkalické: žlutá), Ž – žlučové soli, inhibitor G⁺ bakterií a G^-, které nežijí v zažívacím trakt, G – glukóza, specifický substrát, bakterie čeledi Enterobacteriaceae ho zkvašují za vzniku kyselého prostředí, projeví se zčervenáním v místě reakce.

Půda se očkuje přelivem, nedosouší se, rozlézavé kolonie se potlačí přelitím tenké vrstvy živné půdy nebo vodního agaru po ztuhnutí. Vhodný počet kolonií na Petriho misce je 10 – 150. Kultivuje se při 37 °C, 24 hod.

Vzhled kolonií: Povrchové: velké 1 – 4 mm, světle až jasně růžové nebo růžovofialové, vypouklé, lesklé, pod nimi nebo okolo sraženina (precipitace), vnitřní: menší, kulaté nebo diskovité, tmavší barvy.

Konfirmace kolonií: kolonie se přenesou kličkou frakcionovaně na živnou půdu MPA, po kultivaci 37 °C 24 hod se potvrdí negativní cytochromoxidázový test a provede se očkování vpichem do glukózového agaru, po kultivaci se potvrdí zkvašování glukosy zežloutnutím živné půdy (indikátor bromkresolpurpur).

Živná půda: VČŽL (VRBL), selektivně diagnostická, steriluje se frakcionovaně. Význam složek je stejný jako u stanovení čeledi Enterobacteriaceae, L – laktóza, specifický substrát, koliformní bakterie ho zkvašují za vzniku kyselého prostředí, projeví se zčervenáním v místě reakce.

Vhodný počet kolonií na Petriho misce je 10 – 150. Kultivuje se při 30 °C, 24 hod.

Vzhled kolonií: povrchové velké 1 – 4 mm, světle až jasně růžové nebo růžovofialové, vypouklé, lesklé, pod nimi nebo okolo sraženina (precipitace), vnitřní kolonie jsou menší, kulaté nebo diskovité, tmavší barvy.

Další kultivační živné půdy: Endo-agar, Mc Conkey agar, Levinův agar, Chromocult.

Konfirmace kolonií: kolonie se přenesou kličkou do tekuté živné půdy brilantová zeleň se žlučí a laktózou. Kultivuje se 30 °C, 24 hod. Pozitivní reakce je zákal, tvorba plynu.

Živná půda: Chromocult, Fluorocult, Hicrome E. coli agar. Živné půdy obsahují substrát MUG (4-methyl-umbelliferyl-β-D-glukuronid), který je štěpen enzymem glukuronidáza za vzniku metabolitu, který vytváří specifické zabarvení – chromogenní živné půdy, nebo fluoreskuje po ozáření UV světlem (360 nm) – fluorogenní živné půdy.

Živná půda Chromocult obsahuje Salmon-Gal – koliformní bakterie ho štěpí za vzniku červené barvy, a obsahuje MUG – enzym β-D-glukuronidáza ho štěpí za vzniku modré barvy.

Očkuje se přelivem, vhodný počet kolonií 10 – 150, kultivace 37 °C, 24 hod.

Vzhled kolonií, hodnocení po kultivaci: červené kolonie – koliformní bakterie (mají enzym β-D-galaktosidáza, štěpí Salmon-Gal), sytě fialově modré – Escherichia coli (má oba enzymy, kombinace modré a červené barvy), světle modré – rod Salmonella (má enzym β-D-glukuronidáza, ale nemá enzym β-D-galaktosidáza), bezbarvé kolonie – ostatní zástupci čeledi Enterobacteriaceae, nemají žádný z enzymů).

Konfirmace kolonií Escherichia coli: důkaz tvorby indolu z tryptofanu, tekutá živná půda, po kultivaci přídavek Kovacsova činidla – třešňově červené zbarvení.

Brilliance E. coli/coliform Selective Agar – umožňuje konfirmaci E. coli přímo na kultivační plotně. Purpurové kolonie – na plotnu je aplikováno Kovacsovo činidlo, kolonie E. coli se zbarví jasně třešňově červenou barvou.

Metodou se nestanoví patogenní kmen Escherichia coli 0157:H7, který nemá enzym β-D-glukuronidáza, tedy neštěpí MUG.

DG18 Agar pro vzorky s a_w menší než 0,95 včetně (sušené mléko, …).

DRBC (Dichloran Rose Bengal chloramfenikol Agar) pro vzorky s a_w více než 0,95 (mléko, zakysané výrobky, …).

DG18 Agar se používá pro stanovení počtu životaschopných osmofilních kvasinek a plísní v potravinách živočišného i rostlinného původu s aktivitou vody nižší než nebo rovnající se 0,95. Toto médium není vhodné pro posouzení sušených výrobků s aktivitou vody nižší než nebo rovnající se 0,60. Snížení aktivity vody v tomto médiu je dosaženo přidáním glycerolu (přibližně 18 %). Medium obsahuje také antimykotikum dichloran.

Význam jednotlivých složek: pepton – zdroj dusíku a vitamínů, glukóza – zdroj energie, dihydrogenfosforečnan draselný – pufrovací činidlo, síran hořečnatý (zinečnatý, měďnatý) – stimulace růstu hub a sporulace, dichloran – antimykotikum, inhibuje šíření hub a omezuje velikost kolonií, chloramfenikol – inhibuje růst bakterií, chlortetracyklin je širokospektrální antibiotikum, inhibující Gram-pozitivní a Gram-negativní bakterie, bengálská červeň – barvivo, agar – zpevňující činidlo, glycerol – zdroj uhlíku, snižuje vodní aktivitu.

Očkování roztěrem 0,1 ml připraveného vzorku na půdu v Petriho misce. Inkubace při 25 °C po dobu 2 a 5 dnů (DRBC) nebo 5 až 7 dnů (DG18).

Vyhodnocení: pro výpočet se použijí plotny obsahující méně než 150 kolonií.

Počet kvasinek a plísní v gramu nebo mililitru výrobku se vypočte podle obecného vzorce.

GKCH (YGC) – Yeast extract glukose chloramphenicol

G glukóza, K kvasničný extrakt, CH chloramfenikol, Agar

Agar s kvasničným extraktem, glukózou a oxytetracyklinem (OGYE agar)

Očkování přelivem, aerobní inkubace 25 °C, 5 dnů.

Ostatní živné půdy:

Sabouraudův agar (SAB)

Sladinový agar (SA)

Czapkův agar s kvasničným extraktem (CYA)

Agar se sladovým extraktem (MEA)

Agar s kvasničným extraktem a škrobem (YpSs  – Yeast extract Soluble starch)

Agar s maltextraktem a kvasničným extraktem (MEYE – Malt Extract Yeast Extract)

Zdrojem kontaminace mohou být nemocní lidé, hnisající rány, ale také vzduch, syrové maso, zařízení apod. Otrava se projevuje zvracením, průjmem, nevolností, … Obvykle rychle odezní, ale mohou být v závažných případech spojeny s dehydratací a šokem. Onemocnění může vyvolat toxin vyprodukovaný 10⁵ – 10⁶ KTJ v 1 g potraviny.

Kultivační medium: agar podle Baird-Parkera (BP), očkování 0,2 ml roztěrem, aerobní kultivace při 35 nebo 37 °C, 48 h, jako inhibitor se používá teluričitan draselný a chlorid lithný.

Činnost Staphylococcus aureus, se projeví čirou zónou kolem kolonie s bílým prstencem vysrážených vápenatých a hořečnatých solí mastných kyselin v těsné blízkosti kolonie (došlo k rozkladu lipoproteinů a lipovitelininu žloutku v živné půdě).

Typické kolonie jsou černé, lesklé, vypouklé a jsou obklopeny zónou projasnění, která může být zčásti zakalená. V zóně projasnění v těsné blízkosti kolonií se může po inkubaci 24 h objevit opalescentní prstenec.

Atypické kolonie mají podobný vzhled, avšak zóna projasnění chybí (Staphylococcus epidermidis tvoří světlé kolonie bez projasnění, Bacillus a Proteus tvoří kolonie hnědé).

Agarová půda s králičí plazmou a fibrinogenem (RPF agar) – koaguláza pozitivní stafylokoky na této půdě vytvářejí černé, šedé nebo dokonce bílé malé kolonie obklopené zónou precipitace, která indikuje koagulázovou aktivitu.

K detekci jsou běžně používány imunologické metody: reverzní pasivní latexová aglutinace, ELISA, ELFA.

Metody využívané při konfirmaci, identifikaci a typizaci: tvorba hemolýzy na krevním agaru, reakcí s fibrinogenem králičí plazmy (tvorba chuchvalců, sraženin nebo úplné ztuhnutí plazmy ve zkumavce), průkaz přítomnosti vázané koagulázy (clumping faktor – Dryspot Staphytest Plus).

Další metody: např. PCR s využitím specifických primerů lze detekovat a identifikovat druh Staphylococcus aureus, i prokázat přítomnost genů kódujících tvorbu stafylokokových enterotoxinů a dalších faktorů virulence a také genů kódujících rezistenci k antimikrobiálním látkám (např. MRSA kmeny).

Vyvolává horečku, bolesti hlavy, nevolnost, zvracení, septikémii, meningitidu, encefalitidu, potraty apod., podle typu onemocnění.

Pro kultivaci se používají živné půdy obsahující látky inhibující růst doprovodné mikroflóry (např. chlorid litný, akriflavin, polymyxin), dále eskulin, který listerie štěpí na eskuletin, jenž s citrátem železitoamonným tvoří hnědočerný barevný komplex.

Při průkazu Listeria monocytogenes se vzorek inokuluje do tekuté selektivní půdy pro primární pomnožení – poloviční bujón podle Frasera (poloviční FB médium) při 30 °C 24 h. Získaná kultura se přeočkuje do tekuté selektivní půdy pro sekundární pomnožení – bujón podle Frasera (FB médium). Z primárního i sekundárního pomnožení se provádí vyočkování na dvě pevné selektivní půdy – agar pro listerie podle Ottavianiho a Agostiho (ALOA agar) a kteroukoli jinou selektivní půdu (např. PALCAM agar) při 37 °C 24 h. Nakonec se provede konfirmace vybraných suspektních kolonií.

Listeria monocytogenes na ALOA agaru se projeví modrozelenou barvou kolonií (aktivita enzymu galaktosidáza) a výraznou zónou precipitace (aktivita enzymu fosfolipáza C).

Konfirmace vybraných kolonií: API Listeria test, Rapid L. mono test, CAMP test.

Alternativní způsoby detekce listerií v potravinách – PCR, LCR, hybridizace, amplifikace specifických úseků RNA, ELFA, ELISA nebo imunochromatografická technika na membráně, Imunosenzor, apod.

Stanovení Cronobacter sakazakii v potravinách se provádí kvalitativně. Ke kultivaci se používají neselektivní pomnožovací média a dále selektivní tekuté půdy obsahující látky inhibující růst doprovodné mikroflóry (např. vankomycin), k vlastní izolaci se používají chromogenní půdy. Suspektní kolonie jsou konfirmovány na základě tvorby žlutého pigmentu a vybraných biochemických reakcí.

Vzorek se nejdříve homogenizuje v pufrované peptonové vodě (PPV) 37 °C 16 – 20 h. Kultura se pak přeočkuje (0,1 ml) do selektivní tekuté půdy – modifikovaná laurylsulfát tryptózová půda s vankomycinem (mLST médium) 44 °C 24 h. Ze selektivního pomnožení se provede vyočkování na pevnou chromogenní půdu – Enterobacter sakazakii izolační agar (ESIA agar) 44 °C 24 h, nebo jinou chromogenní půdu poskytující shodné výsledky.

U vybraných kolonií se provede konfirmace – posouzení tvorby žlutého pigmentu a biochemické aktivity (oxidáza, utilizace aminokyselin, fermentace cukrů, hydrolýza citrátů). Metody využívané při konfirmaci, identifikaci a typizaci – ENTERO test, molekulárně biologické metody (např. sekvence DNA, PFGE).

Stanovení: využívá se selektivně diagnostická živná půda MYP (žloutkový agar s polymyxinem B a fenolovou červení). Význam složek: M mannitol – alkoholový cukr, není zkvašován, Y vaječný žloutek, žloutková emulse (yolk) – zdroj lecithinu, při reakci vzniká precipitace, P polymixin B – antibiotikum, inhibitor, potlačuje doprovodnou mikroflóru, fenolová červeň – indikátor pH (kyselé – žlutá, neutrální – červená), další složky – masopeptonový extrakt, pepton, NaCl, agar, voda.

Vzorek se očkuje na předsušenou plotnu živné půdy (30 min při 50 °C) 0,1 ml (0,2 ml) vzorku nebo ředění roztěrem paralelně do dvou misek, nechá se vsáknout 15 min. Inkubace 30 °C 18 až 24 hodin aerobně. Počítají se misky s méně než 150 koloniemi. Typické kolonie jsou drsné, suché, růžové, okrouhlé, obklopené prstencem bílého až narůžovělého precipitátu (tvorba lecitinázy), půda se zabarví červeně (mannitol není zkvašován), kyselinotvorné bakterie mohou potlačit červenání – konfirmace kolonií s precipitací.

Konfirmace: z každé plotny se vybere po pěti koloniích. Kultivace v glukózovém agaru s bromkresolpurpurem (30 °C 18 až 24 hodin) – žluté zbarvení celého sloupce. Voges – Proskauerova reakce – inkubace 30 °C 24 hodin, pozitivní reakce – eosinově růžové zbarvení živné půdy (1 ml po kultivaci v VP testu do zkumavky + 0,2 ml 40% NaOH + 0,6 ml roztoku α-naftolu + několik krystalků kreatinu, protřepat, počkat 1 hodinu), z dalších metod – redukce dusičnanů, mikroskopický preparát – tvorba spor.

Stanovení Clostridium perfringens na živné půdě TSC (tryptososiřičitanový agar s cykloserinem).

Očkování přelivem, kultivace dnem vzhůru v anaerostatu 18 až 20 hodin při 37 °C. Typické kolonie – černé, čočkovité, vatovité (chomáčkovité) kolonie od průměru 2 mm.

Konfirmace: vybere se deset typických kolonií, které se kultivují na základním mediu bez cykloserinu. Poté se zjišťuje pohyblivost vpichem do sloupce živné půdy, anaerobní kultivace 24 hodin 37 °C (bez pohybu, růst jen v linii vpichu); redukce dusičnanů – anaerobní kultivace 24 hodin 37 °C, přidá se činidlo na přítomnost NO^2- 0,5 ml (zčervenání); zkvašování laktózy a ztekucování želatiny – půda s fenolovou červení, anaerobní kultivace 24 hodin 37 °C (zežloutnutí půdy a ztekucení půdy); mikroskopický preparát – Gramovo barvení, přítomnost spor.

Salmonely se nachází v zažívacím traktu ptáků, plazů, hmyzu, zvířat a člověka. Jsou vylučovány s fekáliemi a kontaminují životní prostředí a potraviny, zejména syrové maso (nejčastěji drůbeží a vepřové), cukrářské a lahůdkářské výrobky, syrové mléko, vejce apod.

Stanovení salmonel v potravinách se provádí kvalitativně. Ke kultivaci se používají neselektivní pomnožovací média (pufrovaná peptonová voda (PPV) 37 °C, 20 h). Dále pomnožení ve 2 tekutých selektivních půdách – Rappaport Vassiliadis sója médium (RVS médium) a Mueller-Kauffman tetrationát novobiocin médium (MKTTn médium) 24 h, 41,5 °C. Vyočkování se provádí na dvě pevné selektivní půdy – agar s xylózou, lyzinem a deoxycholátem (XLD agar) 24 h, 37 °C a selektivní půdu např. agar s fenolovou červení a brilantovou zelení (BR agar) nebo chromogenní agar pro stanovení salmonel (např. Rambach agar, IRIS Salmonella agar).

Biochemická konfirmace – růst na TSI agaru, průkaz štěpení močoviny, průkaz lyzindekarboxylázy, průkaz β-galaktosidázy, VP test a průkaz tvorby indolu. Je možné použít komerční identifikační soupravy (např. ENTEROtest, API test). Po biochemické identifikaci následuje sérologická konfirmace a sérotypizace, která je zaměřena na průkaz somatických (O) a bičíkových (H) antigenů, příp. i antigenů povrchového pouzdra (Vi) aglutinační reakcí.

Další metody stanovení salmonel: ELISA a ELFA, imunochromatografické detekční sety, metody PCR (např. multiplex či real-time PCR, RFLP-PCR), využít lze i metodu pulzní gelové elektroforézy (PFGE).

Živné médium: Agar dle Slanetz-Bartleyové (pepton, kvasničný extrakt, glukosa, K₂HPO₄, agar, selekce přítomnosti 4% NaN₃, 1% TTC – je redukován na červený formazan)

Očkování roztěrem 0,1 ml, inkubace při 37 °C 44 hodin.

Enterokoky na půdě Slanetz-Bartleyové vytvářejí kolonie 1 – 2 mm v průměru, hnědočerveně až růžově zbarvené, zpravidla okrouhlé, hladké a lesklé. Půda v jejich okolí je zbarvena.

Z každé misky se vybere 5 kolonií, které se podrobí konfirmačním testům – hydrolýza eskulinu a průkaz katalázy.

Kolonie se přeočkují na žluč-eskulin azidový agar, pozitivní rostou v tmavě hnědých až černých drobných koloniích nebo zbarvují dvorec kultivační půdy černě (do 24 hod. inkubace při 44 °C). Katalázový test s 3% H₂O₂ – tvorba bublin kyslíku indikuje kataláza-pozitivní mikroorganizmy.