Mléko poskytuje všechny potřebné živiny pro většinu heterotrofních mikroorganizmů. Obsahuje vodu, laktózu – zdroj energie, rychle se rozkládá na kyselinu mléčnou (octovou, etanol, CO₂, …), mléčný tuk – zdroj energie, rozkládá se na glycerol, mastné kyseliny a až na methylketony, atd. za vzniku chuťově zatuchlých, rybinovitě páchnoucích látek, bílkoviny – kasein a jednoduché bílkoviny – zdroj staveních látek, rozkládají se na albumózy, peptony, polypeptidy, aminokyseliny, NH₃, vznikají chuťově hořké látky, a řadu dalších látek v malém množství.

Podle toho, kdy a jak mléko osidlují mikroorganizmy, rozlišujeme mikroflóru primární (prvotní) – osidluje mléko ve vemeni před dojením a mikroflóru sekundární (druhotnou) – osidluje mléko v průběhu dojení a po dojení.

Přes strukový svěrač se mikroorganizmy dostávají bez obtíží. Jejich množství a druhy jsou závislé na čistotě vemene a na anatomickém postavení struku. Ve strukovém kanálku vytváří mikroorganizmy bakteriální zátku. Ve vyšších částech vemene jsou mikroorganizmy likvidovány přirozenými protilátkami mléka.

Ve vemeni zdravé dojnice najdeme grampozitivní bakterie, zpravidla stafylokoky, mikrokoky, laktokoky, streptokoky, laktobacily a koryneformní bakterie (Corynebacterium bovis) v množství 10¹ – 10² v 1 ml. Primární mikroflóra je soustředěna především v bakteriální zátce a při oddělení prvních střiků se z mléka z větší části odstraní. Z hlediska technologického zpracování nemá žádný velký význam, je-li mléko správně dojeno. Jinak se významně zvýší celkový počet mikroorganizmů.

U nemocných dojnic tvoří primární mikroflóru původci nemoci. Nejčastěji se jedná o pyogenní streptokoky Streptococcus agalactiae, Streptococcus pyogenes a Staphylococcus aureus, výjimečně i Mycobacterium tuberculosis. Na nemoci se mohou podílet i některé gramnegativní bakterie, zejména klebsiely, Pseudomonas aeruginosa a Escherichia coli.

Zánětlivé mikroorganizmy pronikají do vemene strukovým kanálkem, pak mlékojemem do mlékovodů a poté do alveol. Napadené alveoly ztrácí schopnost tvořit mléko, odlupují se ze sliznice a přecházejí do mléka. Do mléka se uvolňují také poškozené buňky epitelu z mlékojemu a mlékovodů. Tím se zvyšuje počet somatických buněk ve mléce, který je jedním z důležitých ukazatelů kvality mléka. Původci nemocí mohou vyvolávat také onemocnění u lidí. Při onemocnění mléčné žlázy se mění i složení mléka a jeho vlastnosti, což negativně ovlivňuje zpracování mléka.

K navýšení primární mikroflóry může dojít také při poškození strukového svěrače při strojním dojení, nebo při oslabení imunitního systému dojnice při podvýživě, podchlazení, únavě, stresu, delším pobytu na slunci apod.

Předcházet nemocem u dojnic lze správným welfare, dodržováním všech pravidel hygieny a sanitace, kontrolou zdraví zvířat, atd.

Běžné chyby při dojení: špatně očištěná spodní část vemena a struky, málo osušené omyté partie vemena (vlhké vemeno a stékající voda jsou významným zdrojem kontaminující mikroflóry), neoddělení první střiků (neoddělení bakteriální zátky), špatný dozor při dojení, neprovedená nebo nedostatečná závěrečná dezinfekce struků. Další chyby: nedostatečné čištění a dezinfekce potrubí a nádrží, nesprávně prováděná filtrace syrového mléka (je nutné včas a pravidelně vyměňovat filtry, jinak se z nich vyplavují mikroorganizmy do mléka). Velký význam má také hygiena stájového prostředí a pracovní režim ve stáji. Při dojení počet mikroorganizmů ovlivňuje i proudění vzduchu a v něm nežádoucí mikroorganizmy. Do vzduchu se dostávají z okolního prostředí, ale také při manipulaci s krmivy a stelivem – zejména různé druhy plísní. Objemná krmiva je proto vhodné dávat až po skončení dojení, nebo nejpozději půl hodiny před začátkem dojení.

Příčinou podráždění mléčné žlázy může být její nadměrné namáhání nebo špatně seřízené dojicí zařízení (špatné seřízení podtlaku, rychlost pulzů a přisávání vzduchu). To pak může vést ke kontaminaci mléka a ke vzniku zánětlivého onemocnění – mastitidy.

Je nutné, aby dezinfekce struků proběhla ihned po skončení dojení. Dezinfekce zařízení se provádí po vypuštění mléka a umytí zařízení. Mléko zanechává na zařízení tenký film obsahující bílkoviny, tuk a laktózu, tedy zdroje živin pro mikroorganizmy. Mikroorganizmy se pak rychle začínají rozmnožovat a jsou velkým zdrojem kontaminace. Po vyčištění zařízení a jeho dezinfekci je nutný výplach pitnou vodou, aby se zbytky čisticích a dezinfekčních prostředků nedostaly do mléka. Je nutné provádět výplach pitnou vodou, užitková voda může být zdrojem hlavně psychrotrofních mikroorganizmů a také jiných nežádoucích mikroorganizmů, které se na povrchu zařízení množí a kontaminují napouštěné mléko.

Počet mikroorganizmů v sekundární mikroflóře se pohybuje mezi 10⁴ – 10⁵ v 1 ml a významně rozhoduje o kvalitě mléka.

Mikroorganizmy v sekundární mikroflóře můžeme rozdělit podle teplotního rozmezí, ve kterém se intenzivně rozmnožují, na mezofilní a psychrotrofní. Mléko po nadojení má teplotu okolo 36 °C, což je vhodné prostředí pro mezofilní mikroorganizmy. Teplotní rozmezí růstu mezofilních mikroorganizmů je 10 – 45 °C, optimální teplota růstu pak 30 – 37 °C.

Mezi nejběžnější zástupce mezofilních mikroorganizmů patří zástupci rodů Lactococcus, Enterococcus, čeledi Enterobacteriaceae (hlavně koliformní bakterie), rodu Lactobacillus, Bacillus, Clostridium a Corynebacterium. Jako první se ve mléce začínají rozmnožovat bakterie zkvašující laktózu – laktokoky. Nachází se na rostlinách, které jsou součástí píce. Způsobují homofermentativní mléčné kvašení s převažující tvorbou kyseliny mléčné. Kyselina mléčná působí regulačně na ostatní skupiny mikroorganizmů. Pokud jsou ve mléce přítomny inhibiční látky, je jejich rozvoj brzděn. Z výkalů dojnice při špatné hygieně získávání mléka se do mléka dostávají koliformní bakterie, které vyvolávají heterofermentativní mléčné kvašení s tvorbou nepříjemného aromatu a plynu (H₂ a CO₂). Koliformní bakterie jsou střevní bakterie, rychle se rozmnožují, mohou indikovat fekální znečištění, pasterací se ničí.

S částečkami krmiva, steliva a zeminy, popřípadě z výkalů, se do mléka dostávají sporotvorné mikroorganizmy rodů Bacillus a Clostridium. Mikroorganizmy rodu Bacillus jsou částečně inhibovány bakteriemi mléčného kvašení. Aktivita sporotvorných bakterií se projeví až po deseti dnech, pasteraci běžně přežívají. Způsobují vady převážně u výrobků, které mají delší trvanlivost.

V současné době se mezofilní mikroflóra významně po nadojení nerozmnožuje, protože se mléko po nadojení okamžitě chladí a pro tyto mikroorganizmy se tak vytvoří nevhodné rozmnožovací podmínky.

Hluboké a rychlé chlazení nese ale rozvoj psychrotrofní mikroflóry. Mléko se chladí na teplotu 0 – 6 °C. Psychrotrofní mikroorganizmy jsou převážně gramnegativní bakterie. Mezi hlavní představitele patří zástupci rodů Pseudomonas a Flavobacterium. Patří sem také některé psychrotrofní kmeny mezofilních druhů mikroorganizmů a také některé kvasinky a plísně. Do mléka se dostávají ze znečištěné vody, z půdy, ze špatně vyčištěného zařízení apod. Ve mléce je růst laktokoků neomezuje, laktózu nezkvašují a neokyselují mléko. Rozkládají bílkoviny a tuky za vzniku nepříjemných pachů a chutí (hořknutí, táhlovitost, …). Jsou technologicky nebezpečné, mnohé z nich tvoří enzymy lipázy a proteázy. Tyto enzymy jsou termostabilní, při pasteraci se neničí a v hotových výrobcích jsou zdrojem vad při skladování a zrání výrobků. Množství a rozsah vad jsou závislé na kontaminaci syrového mléka, délce skladování před pasterací a skladovací teplotě.

Mléko může být zdrojem patogenních mikroorganizmů, které se přenáší ze zvířat na lidi – např. mastitida, slintavka, kulhavka, sněť slezinná, kravské neštovice, brucelóza, Q-horečka, salmonelóza, botulizmus. Prostřednictvím mléka se přenášejí lidské nemoci – např. úplavice, tyfus, paratyfus, záškrt, spála, angína, dětská obrna a různé nemoci zažívacího traktu. Z kvasinek jsou nebezpečné Cryptococcus neoformans, z plísní spory rodu Aspergillus – tvoří mykotoxiny, které mohou přecházet i z krmiva. Mlékem mohou být přenášeny i viry, které způsobují např. klíšťovou encefalitidu, hepatitidu A. Většina mikroorganizmů se ničí záhřevem, přežívají pouze sporotvorné a termorezistentní. Díky proočkování lidské populace i zvířat se naštěstí se spoustou nemocí nesetkáme vůbec, nebo jen v některých rozvojových zemích.

Počet mikroorganizmů v syrovém mléce může být různý. Vysoký počet je technologicky nežádoucí a je s ním spojeno riziko změn ve složení mléka (rozklad laktózy, bílkovin i tuků), hromadění enzymů lipáz a proteáz (nejsou inaktivovány pasterací!) a relativně vysoké zastoupení termorezistentních mikroorganizmů přežívajících pasteraci. Dříve způsobovala potíže hlavně mezofilní mikroflóra, dnes, s nástupem dokonalého chlazení, došlo téměř k jejímu zastavení. Dobré chlazení ale znamená větší rozvoj psychrotrofních bakterií. Pro dlouhodobé skladování je nejvhodnější teplota do 2 °C, vyšší teploty 4 – 5 °C vedou ke zvýšení počtu psychrotrofních mikroorganizmů. Dlouhodobé skladování mléka při nízkých teplotách ovlivňuje některé fyzikální a fyzikálně chemické vlastnosti mléka a jeho další zpracovatelnost, výtěžnost a jakost hotových výrobků.

Na základě dohody mezi odběratelem a dodavatelem se mohou hodnotit u syrového kravského mléka i doplňkové znaky: